分光光度計の一般的なコンポーネントの原理と応用の紹介

分光光度計は、生物学、化学、臨床、および環境の研究で広く使用されています。
分光測光法は、分光光度計のサンプルに光線を通過させることにより、化学物質が吸収できる光の量を測定します。
検出された光強度を測定することにより、この方法を使用してサンプル中の溶質の濃度を決定できます。
分光測光のコンセプト
サンプルに送信されるビームは、光子ビームで構成されています。
光子がサンプル内の分子と出会うと、分子はそれらの一部を吸収し、ビーム内の光子の数を減らし、検出信号の強度を減らします。
透過率は、サンプルを通過する光の一部です。 入射光強度でサンプルを通過する光強度として定義されます。
吸光度は、分光光度計によって測定された量に対応する透過率の反対です。
吸光度によると、溶液サンプルの濃度は、法案のランバートの法則から決定できます。これは、吸光度とサンプル濃度の間に線形関係があることを示しています。 ビールランバートの法則によれば、吸光度は吸収係数の積であり、これは特定の波長で溶質に吸収される光の量と、光が通過する距離の尺度です。 サンプル、または移動距離、および溶質濃度。 一般に、吸光度を測定する目的は、サンプルの濃度を測定することです。
分光光度計のコンポーネント
各分光光度計は、光源、コリメータ（強力な直線ビームを送信するためのレンズまたは集束装置）、異なる波長のビームを分離するモノクロメータ、および希望する波長の波または溝を選択するための長さセレクタで構成されています。 このビデオで示されている分光光度計で使用されている光の波長は、紫外線と可視光の範囲です。 分光光度計には、サンプルホルダー、光検出器、および検出器の結果を表示するスクリーンも含まれています。
最新の分光光度計はコンピューターに直接接続されており、実験パラメーターを制御して結果を表示できます。
分光光度計の動作原理
分光測光を実施する場合、使用する生物学的または化学的溶液の種類に応じて、手袋を着用するなど、適切な予防措置を取ることが重要です。
デバイスの電源を入れ、ランプと電子機器を加熱してから、サンプルのUV-Visスペクトルを測定します。
同じpHおよび同様のイオン強度で、分析対象の成分を含まない同じ溶液のブランクサンプルを準備します。 キュベットと溶媒は光を分散させる可能性があるため、サンプルを分析する必要があります。
従来の分光光度計のサンプルホルダーは、プラスチックと石英のボウルを保持するように設計されています。 元の溶液をボウルにピペットで入れます。
指紋を拭き取り、ボウルの外側にそれらをはねた後、キュベットをサンプルホルダーに正しく挿入し、蓋のドアを閉じます。
開いている分光光度計からの紫外線が目や皮膚に損傷を与える可能性があるため、ドアを閉めることを忘れないでください。
サンプルに送信される希望の波長または波長範囲をプログラムします。 これは、分析対象のコンポーネントが吸収できる最適な波長に依存します。 次に、空のサンプルを測定することにより、機械をゼロにします。これにより、サンプルバッファーによる底部の吸光度が差し引かれます。
行う分光測光実験の種類によっては、サンプル測定の前に標準曲線を作成する必要があります。この曲線から、サンプルで分析された化合物の濃度を決定できます。
サンプルが適切な温度に到達するようにし、気泡が入らないように穏やかに混合します。 その後、サンプルを機械内部のボウルに直接追加し、読み取りを行うことができます。
サンプルの吸光度が測定された後、実験は適切に計算されます。 例えば、濃度または酵素活性レベルを決定するため。
分光光度計の応用
分光光度計の一般的な用途の1つは、細胞密度の測定です。 細胞密度測定を使用して、細菌の対数増殖曲線を作成し、そこから組換えタンパク質の最適な統合時間を決定できます。
分光光度計は、化学反応速度の測定にも使用できます。 この実施形態では、吸光度は酵素反応を監視するために使用され、酵素反応は452nmの中間反応を通して時間とともに消失する。 この酵素ステップの割合は、データを適切な方程式と照合することで計算できます。
マイクロ分光光度計の導入により、サンプルホルダーが不要になります。 これらの分光光度計は、表面張力を使用してサンプルを維持します。
顕微分光光度計は、タンパク質や核酸などの生体分子などの小さくて高価なサンプルの質量と濃度を測定するのに最適な選択肢です。
280nmでのタンパク質の吸光度は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンに見られる芳香族側鎖の含有量、および2つのシステイン間のジスルフィド結合に依存します。
タンパク質の濃度は、280nmでの吸光度とアミノ酸の組成に基づく吸収係数によって決定できます。
DNAとRNAは260nmで最大吸光度を持ち、そこから濃度を決定できます。 核酸の純度は、吸光度測定値と特定の波長の比から評価することもできます。