分光光度 定量タンパク質定量
タンパク質は、通常、タンパク質の混合物である。 比色アッセイは、タンパク質成分に基づく：アミノ酸（例えば、チロシン、セリン）は、追加の発色基または色素と反応して着色物質を生成する。 有色物質の濃度は、タンパク質が反応するアミノ酸の数に直接関係し、それによってタンパク質濃度を反映する。
比色法
BCA、Bradford、Lowryなどいくつかの方法があります。
Lowry法：最も初期のビウレット反応に基づいて改良されました。 タンパク質はCu2と反応して青色反応を生じる。 しかし、ローリー法はビュレットよりも敏感です。 欠点は、いくつかの異なる試薬を順次添加する必要があることである。 反応には長い時間がかかります。 非タンパク質物質の影響を受けやすい。 EDTA、Triton x-100および硫酸アンモニアを含むタンパク質は、この方法には適していない。
ビシンコニニン酸アッセイ：これは、より新しい、より敏感なタンパク質アッセイである。 分析すべきタンパク質はアルカリ溶液中のCu2と反応してCuを生成し、これはBCAとキレートを形成して562nmに吸収ピークを有する紫色の化合物を形成する。 この化合物とタンパク質との濃度の直線関係は強く、反応後に生成する化合物は非常に安定である。 Lowry法に比べ、操作が簡単で感度が高い。 しかし、ローリー法と同様に、タンパク質および界面活性剤との干渉を受けやすい。
ブラッドフォード法：この方法の原理は、タンパク質がクーマシーブリリアントブルーと反応して、595nmで吸収する着色化合物を生成することである。 その最大の特徴は、LowryとBCAの感度の2倍の感度です。 よりシンプルで高速です。 1種類の反応試薬しか必要としません。 化合物は、結果を促進するために1時間安定であり得る; Lowryと干渉し、BCAは還元剤（例えば、DTT、メルカプトエタノール）と相溶性があります。 しかし、洗剤には依然として敏感です。 主な欠点は、異なる標準が同じサンプルの結果に大きな差異をもたらし、同等の結果をもたらさないことである。
比色測定に最初に曝された研究者の中には、さまざまな比色試験の結果によって混乱することがあります。 どのような方法が混乱していると思いますか？ 基が異なる方法で反応し、発色基が同じでないという事実のために、同じ試料の試料濃度を一貫しないようにするためにいくつかの方法を同時に使用する。 例えば、Keller et al。 ヒト乳中のタンパク質を試験し、LowryおよびBCAによって測定された濃度がBradfordの濃度より有意に高いことを見出した。 その差は有意であった。 同じ試料が決定されたとしても、同じ比色法によって選択された標準試料は不一致であり、試験後の濃度も不一致である。 例えば、標準としてBSA、1.34mg / mlの濃度、および2.64mg / mlの濃度を有する標準としてのグロブリンを使用して、細胞ホモジネート中のタンパク質を試験するためにLowryを使用する。 したがって、比色法を選択する前に、試験される試料の化学組成を参照し、化学的に類似の標準タンパク質を標準として見出すことが好ましい。 さらに、タンパク質を定量するための比色法は、試料の吸光度値が低すぎるため、測定された試料濃度と実際の濃度との間に大きな差が生じるという問題をしばしば引き起こす。 重要な問題は、1011分光光度計の重要な部分であるキュベットの色が一定の半減期を持つため、各比色法で反応試験時間が記載されていることです。 すべてのサンプル（標準サンプルを含む）は、この時間内にテストする必要があります。 時間が長すぎると、得られる吸光度値が小さくなり、換算濃度値が低下する。 さらに、反応温度、溶液のpH値などは実験に影響を与える重要な要素です。 さらに、プラスチック比色計を使用することは非常に重要です。 反応後の色により石英やガラスが着色し、試料の吸光度が不正確になるため、石英またはガラス製のキュベットを使用しないでください。
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